Ông trấn trị đất Thuận Hóa và Quảng Nam đến tháng 6 năm Quý Sửu (1613) thì mất, thọ 88 tuổi. Nguyễn Hoàng có 8 người con trai nhưng bốn người con đầu là Nguyễn Phúc Hà, Nguyễn Phúc Hán, Nguyễn Phúc Thành và Nguyễn Phúc Diễn thì đã chẳng may qua đời sớm. Năm 1600, khi Nguyễn Hoàng vào ở hẳn tại Thuận Hóa, ông có gửi người con trai thứ năm là Nguyễn Phúc Hải ở lại đất Bắc làm con tin, theo ông lúc đó chỉ còn người con trai thứ sáu là Nguyễn Phúc Nguyên, con trai thứ bảy là Nguyễn Phúc Hiệp và con trai thứ tám là Nguyễn Phúc Trạch. Trong ba người con này, Nguyễn Phúc Nguyên được Nguyễn Hoàng tin cậy, giao phó cho việc trấn giữ đất Quảng Nam. Theo Đại Nam thực lục (Tiền biên, quyển 1), khi biết mình không thể sống được nữa, Nguyễn Hoàng đã cho gọi Nguyễn Phúc Nguyên từ Quảng Nam về, lại sai gọi, những quan lại thân tín đến và dặn dò như sau:
“Ta với các ông, từng đồng cam cộng khổ đã lâu, một lòng gầy dựng nghiệp lớn. Nay, ta để gánh nặng lại cho con ta, các ông nên dốc lòng giúp đỡ, quyết thành cơ nghiệp mới thôi. Nói rồi, Chúa cầm tay Hoàng tử thứ sáu (chỉ Nguyễn Phúc Nguyên. Hai chữ Hoàng tử là do người viết sử đời sau tự ý thêm vào – ND), dặn bảo:
– Đạo làm con thì phải hiếu, làm tôi thì phải trung, cho nên, anh em trước hết phải thương yêu nhau. Con mà nhớ được lời dặn này thì ta không còn ân hận gì. Xong, Chúa lại nói tiếp:
– Đất Thuận Quảng, phía Bắc có Hoành Sơn và Linh Giang (tức sông Gianh – ND) hiểm trở, phía Nam có Hải Vân và Thạch Bi (tức núi Bia Đá ở Phú Yên – ND) rất vững bền. Núi sẵn vàng, sẵn sắt, biển lắm cá, lắm muối, thật đúng là chỗ dụng võ của người anh hùng. Nếu biết luyện binh để chống chọi với họ Trịnh thì có thể xây dựng cơ nghiệp đến muôn đời. Ví bằng thế lực không chống nổi, thì cứ cố giữ vững đất đai để chờ cơ hội, đừng bỏ qua lời dặn của ta.
Hoàng tử thứ sáu và các quan lại thân tín đều khóc lạy mà vâng mệnh. Hôm ấy Chúa băng, ở ngôi tất cả 56 năm, thọ 88 tuổi. Đầu tiên đem táng ở núi Thạch Hãn, thuộc huyện Hải Lăng (nay thuộc tỉnh Quảng Trị – ND), sau cải táng ở núi La Khê, huyện Hương Trà (nay thuộc tỉnh Thừa Thiên – Huế – ND)”.
Lời bàn:
Di chúc của Nguyễn Hoàng, nói gọn lại là thể không đội trời chung với họ Trịnh, mà muốn làm được điều đó, anh em phải hòa thuận, quan lại phải biết giữ lòng trung nghĩa. Lời vĩnh quyết của Nguyễn Hoàng, lời của người thuộc hàng thượng thọ hiếm hoi ở thời loạn, quả là đáng suy gẫm lắm thay. Nghiêm dạy con mình là đó mà khéo léo kết hợp giữa động viên với răn đe những người thân tín cũng là đó. Buồn vui khó nói, nhưng dẫu sao thì di chúc của Nguyễn Hoàng cũng được con cháu của ông thực hiện khá trọn vẹn. Đáng sợ thay, đại lão khơi nguồn xứ Đàng Trong!
(Theo Việt sử giai thoại của Nguyễn Khắc Thuần)